无患子皂苷提取及在抗敏化妆品中的应用

广东省技术交流协会专家    刘宪俊

摘    要

简介了抗敏化妆品的应用现状，综述了无患子皂苷的成分结构、药理作用及提取方法，提出了无患子皂苷在抗敏化妆品中的应用思路。文章通过醇提－过柱和水提－过柱法提取了无患子皂苷，并配制了无患子皂苷抗敏乳霜。采用高效液相色谱法和紫外分光光度法测定了无患子皂苷的纯度，透明质酸酶抑制率法测试了无患子皂苷的直接抗敏效果。最后评测了无患子皂苷添加于化妆品乳霜的抗敏效果，结果显示，无患子皂苷乳霜具有优良的抗敏舒缓作用。

关键词：无患子皂苷  醇提  水提  抗敏性

Extraction of sapindoside and its application in anti-allergy cosmetics

Liu Xianjun

Abstract: Sapindoside is a common cultivated plant and also a kind of a wide range of Chinese herbal medicine. It can prevent and treat various of skin diseases and can be used as a natural surface active substance used in natural shampoo and all kinds of skin cleansing and caring cosmetics.

This article will use two methods, refluxing extraction by ethanol aqueous solution and separation by macroporous resin and refluxing extraction by water and separation by macroporous resin to extract the Sapindoside. Results show that after alcohol extraction and macroporous resin separation the purit of saponinis 70.89%, water extraction and macroporous resin separation the purit of saponinis 30.98%. The macroporous resin can effectively separate and purify the active ingredients of sapindus. Comparing the effect of alcohol and water to extract saponin, alcohol extraction is better. The inhibition rate of hyaluronidase of sapindus saponinsis 37.04%, showing that it have certain anti-allergic effect and the higher the purit is, the better the anti-allergic effect is. In the application, the anti-allergic effect is best when saponins adding amount is 1% in cream products.

Keywords: Sapindoside, Alcohol extraction, Water extraction, Anti-allergy effect

一．前言

1.1 抗敏化妆品现状

2017年，化妆品的安全性愈发受到消费者的严重关注。由于环境的恶化、皮肤敏感人群增多以及对安全性的重视，抗敏化妆品的需求在近几年呈现出急剧上升的趋势。在淘宝及天猫网上可以看到，2016年平均每日“护肤品”关键词搜索达12000多次，“抗敏药妆”搜索量占到27.5%，比2015年度增长8.3%，此趋势预测将逐年增长。

很多护肤品牌推出针对敏感肌肤的化妆品，并在逐年增多。国外品牌如雅漾、玫琳凯、理肤泉、薇姿、兰蔻等产品成熟、产品线多；国内抗敏品牌相对较少，较为出名的有上海家化的佰草集、相宜本草、广州环亚的法兰琳卡等。如何在品牌琳琅满目的高端化妆品市场，打造出民族品牌来，是化妆品研发人员的一道神圣使命。中药因其安全性在国内拥有悠久的传统市场，通过传统中药与现代化妆品结合，主打草本天然、中药养肤概念，打造现代中草药护肤品，无疑是引领当前趋势、提高国产档次的一个很好的切入点。

1.2 无患子皂苷

无患子的根、皮、叶、果皮、种子、种仁均具有很强的药用价值，其汁液的pH在5~7之间，呈自然酸性，泡沫丰富，手感细腻，去污力强。林文荣^[1]发现无患子种仁油含有大量对人体有益的不饱和脂肪酸，是优良的植物油。张蕾^[2]辗碎熬煮无患子果皮流出来的热汁，再经冷却后得到具有黏性的皂乳，皂乳沉于底部易与水分离浓缩，再经多次脱色去除杂质精制成皂乳，产品无味微黄，接近透明的黏性液体，无需添加防腐剂就可长久保存。

无患子皂苷是无患子果皮的主要活性成分，也是《本草纲目》中唯一记载用于洗发洗面的中草药，在美容护肤方面有良好的效果，拥有广泛的开发前景。无患子皂苷主要包括四种类型：五环三萜类齐墩果烷型、四环三萜类大戟烷型、达玛烷型和倍半萜型，其中以三萜类为主^[3]。无患子皂苷可以分解油脂，渗入毛孔，把粉刺乳化或液化，使之自然流溢，不再阻塞，从而降低青春痘的发生率。洗头时，取适量皂乳涂抹并按摩头皮，可预防头皮屑。录丽平等^[4]发现无患子皂苷对小菜蛾和果蝇有一定的生物活性，且对果蝇活性较高，浓度为50mg/mL时，72h果蝇的死亡率可达到100%，对害虫具有良好的抑制和杀灭作用。Park Zun-Hee^[5]对无患子皂苷的安全性进行了研究，证实其毒性、溶血性和皮肤刺激性都很低。赵志敏等^[6]通过体外抑菌实验，分别测定了无患子总皂苷对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等5种常见的皮肤致病菌的抑菌活性并测定了其清除超氧阴离子自由基、羟自由基能力，结果表明无患子总皂苷对细菌和真菌均有强抑制作用，及强抗氧化活性。Huang HC等^[7]从无患子中分离出6种新皂苷，发现皂苷对人肿瘤细胞具有温和的细胞毒性作用，表明无患子具有一定的抗肿瘤作用。Mohammed等^[8]报道在体内和体外实验中，无患子皂苷均对四氯化碳诱导的肝脏损伤具有保护作用。

图1为常见无患子皂苷结构，主要有无患子皂苷A、无患子皂苷B和无患子皂苷元三种结构。

图1  常见无患子皂苷的分子结构

1.3 无患子皂苷提取方法

无患子皂苷的提取方法有很多，传统的有水提法和醇提法。一般是先将果皮干燥粉碎后，以一定的料液比多次回流提取皂苷，但所耗溶剂多、回收困难、反应时间长、得率低。近年来随着技术的进步，提取方法有所优化。魏凤玉等^[9]采用酶法提取无患子皂苷，研究了酶的类型对无患子皂苷提取的影响，并通过正交实验优化酶法提取工艺。结果表明，纤维素酶能破坏果皮细胞壁结构，有助于无患子皂苷的提取，酶提法的较优工艺条件为：纤维素酶用量为无患子粉末质量的0.1%，酶提时间2.5h，温度50℃，pH值4.7，无患子皂苷的提取率可达86.59%，比未加酶处理时提高了19.63%。张静^[10]采用泡沫分离法纯化无患子皂苷，通过精馏塔式操作、大孔径鼓泡器时泡沫分离效果较好。无患子皂苷的富集比随着进料液浓度的增加、气体流速的增大、进料高度的上升逐渐减小，而收率、纯度随之增大。马育彪等^[11]用水提法，大孔树脂分离纯化无患子中总皂苷，提取分离效果较好，且成本较低，适合工业放大生产。赵丹青等^[12]采用超声波辅助法提取无患子皂苷，可以减少用水量、降低能耗、提高皂苷得率。提取优化工艺为：超声频率20kHz，超声时间20min，料液比1：6，超声功率800W，提取温度60℃，皂苷得率为37.27%。

1.4 实验思路

研究表明，透明质酸酶是过敏反应参与者，与过敏有强相关性，许多抗过敏药物有强抑制透明质酸酶活性的作用^[13]。透明质酸酶体外抑制试验具有可同时分析多种样品的优点，与传统方法相比样本量小、时间短、成本低，被广泛用于检测抗过敏特性成分的筛选与评价^[14]。本文拟采用醇提－过柱分离纯化和水提－过柱分离纯化两种方法提取无患子皂苷，采用透明质酸酶体外抑制试验测试其抗敏性，探讨无患子皂苷用于抗过敏化妆品的可行性，以期研制出一种性能优良的日用抗敏中药护肤品。

二．实验试剂和仪器

无患子果皮，河北省安国市瑞琪中药材有限公司；无水乙醇、浓硫酸、甲醇，天津市富宇精细化工有限公司；甲萘酚、冰醋酸、对－二甲氨基苯甲醛，上海润捷化学试剂有限公司；香草醛，天津市福晨化学试剂厂；高氯酸，国药集团化学试剂有限公司；结晶乙酸钠，天津市福晨化学试剂厂；透明质酸酶，北京索莱宝科技发展公司；透明质酸钠，力德生物工程有限公司；乙酰丙酮，江苏强盛化工有限公司；无水氯化钙、碳酸钠、浓盐酸、氢氧化钠，广州化学试剂厂；AB-8大孔树脂、HZ-801大孔树脂，郑州勤实科技有限公司。

FM200均质机，上海弗鲁克有限公司；DFY-300粉碎机，浙江温岭市林大机械有限公司；SHA-C恒温水浴锅、SHA-C紫外分光光度计，广州市正一科技有限公司；GZX-9070旋转蒸发仪，上海嘉鹏科技有限公司；6890高效液相色谱仪，美国安捷伦（Agilent）公司。

三．实验方法

3.1 预处理

3.1.1 无患子果皮

无患子果皮洗净，于通风处风干，放入干燥箱60℃烘5h，再用粉碎机粉碎，过60目筛，得无患子粉末。

3.1.2 大孔树脂

新树脂用清水浸泡24小时，再用95%的乙醇浸泡4h，最后用蒸馏水洗涤至清澈且无醇味。

3.1.3 树脂装柱及再生

湿法装柱，树脂装柱高约为柱的1/3至1/2，树脂用适量蒸馏水混合缓慢倒入柱中，自然沉降，控制溶剂液面高于树脂面，用橡皮管敲打柱子挤走气泡，塞入棉花密封。

使用完后的树脂，分别用4%NaOH和4%HCl浸泡3h，水洗至中性，再用95%乙醇浸泡4h，水洗至液体澄清，晾干后树脂可再次使用。

3.2 无患子皂苷的提取

3.2.1 醇提、过柱无患子皂苷

（1）醇提

烧瓶中加入无患子粉末50g。70%乙醇为溶剂，1：3物料比，在75℃恒温水浴中回流提取3次，时间分别为3h、2.5h、2h，合并3次的醇提液，调pH=8.5，滤除沉淀，旋蒸减压回收乙醇，浓缩液调为中性。

（2）过柱

用蒸馏水洗脱预处理的AB-8树脂柱，直至流出液无molish反应；再用70%和95%的乙醇，以2.5倍树脂床的体积量洗脱，收集洗脱液，减压蒸馏得浓缩液，60℃烘干，得醇提过柱无患子皂苷。

3.2.2 水提、过柱无患子皂苷

（1）水提

烧瓶中加入无患子粉末20g，蒸馏水为溶剂，1：5物料比，在55℃恒温水浴中回流提取3次，时间分别为3h、2.5h、2h，合并3次的水提液，调PH=3~4，静置过夜，滤除沉淀，调pH为中性。

（2）过柱

用蒸馏水洗脱预处理的HZ-801树脂柱，直至流出液无molish反应；再用35%、70%、95%的乙醇，以2.5倍树脂床的体积量洗脱，收集洗脱液，减压蒸馏至无醇味，得水提过柱无患子皂苷。

3.3 抗敏乳霜的制备

表1  抗敏乳霜配方

按表1配方，将水相和油相分别置于恒温水浴锅内，90℃加热搅拌至完全熔化，搅拌下将油相1缓慢倒入水相中，停止加热，65℃时加入油相2，以3000rpm均质5min，继续搅拌至常温，添加无患子皂苷提取物搅拌均匀，配制成无患子皂苷抗敏乳霜。

四．检测方法

4.1 无患子皂苷的纯度

4.1.1 方法概要

由于市面上无合适的无患子皂苷标准品，而未过柱、水提无患子皂苷存在杂质多、甲醇难溶等问题，故本实验用高效液相色谱测定醇提过柱无患子皂苷的纯度，再以醇提过柱无患子皂苷作为对照品，通过紫外分光光度法测定醇提未过柱无患子皂苷、水提过柱无患子皂苷、水提未过柱无患子皂苷的分光度，绘制皂苷吸光度回归曲线，根据回归曲线方程计算无患子皂苷的纯度。无患子皂苷的产率可通过无患子皂苷的纯度计算得出，见下式。

无患子皂苷产率＝无患子皂苷产量×无患子皂苷纯度÷无患子质量×100%

4.1.2 高效液相色谱法

取少量醇提过柱无患子皂苷，用甲醇溶解成1mg/mL的溶液，在Agilent C₁₈色谱柱，甲醇：水体积比为54：46、56：44、100：0比例梯度洗脱；波长210nm、85min测定醇提过柱无患子皂苷的纯度。

4.1.3 紫外分光光度法

用甲醇溶解醇提过柱无患子皂苷粉末14mg，定容至10mL，抽100μL注于磨口试管中，加入5%香草醛－冰醋酸溶液0.4mL和高氯酸1.6mL，摇匀，试管加塞密封，置于70℃水浴显色15min，再冰水浴2~3min，加入冰醋酸10mL，摇匀，配成皂苷对照液。按3.1.2的操作步骤，200~700nm全波长扫描对照空白培养液，得出最大吸收波长，在此波长下，测定皂苷对照液50μL、100μL、150μL、200μL、250μL时的吸光度，绘制无患子皂苷的吸光度回归曲线。

分别量取100μL醇提未过柱无患子皂苷、水提过柱无患子皂苷、水提未过柱无患子皂苷溶解，按以上方法测定吸光度，平行测定3次，根据回归曲线方程计算皂苷的纯度。

4.2 透明质酸酶抑制率

4.2.1 试剂配制

醋酸缓冲液：量取1.2mL冰乙酸用水稀释成100mL，取9.6mL作为溶液A；称取2.72g结晶乙酸钠加水溶解至100mL，取90.4mL作为溶液B；混合溶液A、B，并用溶液A、B调pH至5.6。

透明质酸酶液：称取透明质酸酶10mg置于烧杯中，加入醋酸缓冲液4mL溶解均匀。

透明质酸钠液：称取透明质酸钠5mg置于烧杯中，加入醋酸缓冲液10mL溶解均匀。

乙酰丙酮液：称取乙酰丙酮3.5mL溶于50mL的1mol/L碳酸钠溶液中。

埃尔利希试剂：称取对－二甲氨基苯甲醛0.8g溶于体积比为1：1的浓盐酸、无水乙醇混合液中，搅拌均匀。

4.2.2 操作步骤

用乙醇分别溶解醇提过柱无患子皂苷、醇提未过柱无患子皂苷、水提过柱无患子皂苷、水提未过柱无患子皂苷4种试样，配成0.1g/mL的皂苷稀释液。取0.25mmol/L的CaCl₂溶液0.1mL和透明质酸酶液0.5mL于37℃培养20min；加入皂苷稀释液0.5mL，保持37℃培养20min；加入0.5mL透明质酸钠液37℃保温30min，常温放置5min；加入0.4mol/L的NaOH溶液0.1mL和乙酰丙酮液0.5mL，置于沸水浴中加热15min，冰水浴冷却5min；加入埃尔利希试剂1.0mL及无水乙醇3.0mL稀释，配成皂苷培养液，放置20min至显色，用紫外分光光度计在波长525nm下测定皂苷培养液的吸光度。

4.2.3 计算

式中：

A：对照培养液（醋酸缓冲液代替试样）的吸光度；

B：对照空白培养液（醋酸缓冲液代替试样及透明质酸酶液）吸光度；

C：皂苷培养液吸光度；

D：皂苷空白培养液（醋酸缓冲液代替透明质酸酶液）吸光度。

4.3 乳霜抗敏效果

取医用纱布剪成面积为1cm²大小，涂40mg无患子皂苷乳霜，贴在手臂内侧并盖上聚丙烯塑料薄膜，用医用胶布固定，试验期间试用者不食用刺激性食物，实验部位不沾水。24h后揭开观察。另用15%的果酸溶液涂抹敏感部位肌肤使其过敏，再使用无患子皂苷乳霜涂抹，评价其抗敏效果。

五．结果与讨论

5.1 纯度和吸光度

5.1.1 醇提过柱无患子皂苷

（1） 纯度

高效液相色谱测定醇提过柱无患子皂苷如图2所示，无患子皂苷在高效液相色谱图中有多个波峰出现，说明无患子皂苷中含有大量的皂苷单体^[15]，无患子存在多个皂苷单体，其保留时间主要集中在17~25min。从图2可以看出，在17.453min，21.589min和24.972min的峰型较好，峰高识别度高，可知这三个峰为无患子皂苷A，无患子皂苷B和无患子皂苷元的识别峰。根据回归曲线面积归一法，计算出醇提过柱无患子皂苷的纯度为70.89%，说明乙醇提取、大孔树脂分离的方法可行。

图2  无患子皂苷的高效液相色谱图

（2） 吸光度

醇提过柱无患子皂苷的进样量与吸光度关系如图3所示。

从图3可知，醇提过柱无患子皂苷进样量在50μL~250μL的范围内，皂苷含量与吸光度的线性关系良好，此时回归曲线方程为y=0.002x－0.0063，相关系数R²＝0.9993，可作为评价无患子皂苷含量的标准品。

图3  醇提过柱无患子皂苷进样量与吸光度关系

5.1.2 醇提未过柱无患子皂苷

醇提未过柱无患子皂苷的吸光度与纯度如表2所示。

表2  醇提未过柱无患子皂苷的吸光度与纯度

由表2可知，醇提未过柱无患子皂苷的纯度为33.3%，其相对偏差较小，实验的重复性较好，可信度高。醇提未过柱无患子皂苷为深红棕色溶液，液体有一定黏度，无泡沫。提取液干燥后得7.35g棕黄色无定型粉末，产率为10.42%。

5.1.3 水提过柱无患子皂苷

水提过柱无患子皂苷的吸光度与纯度如表3所示。

表3  水提过柱无患子皂苷的吸光度与纯度

由表3可知，水提过柱无患子皂苷纯度为30.98%，相对偏差较小，实验的重复性较好，可信度高。经树脂纯化后的水提过柱无患子皂苷溶剂量大，较难干燥，故只对提取液进行浓缩操作，浓缩液为深红棕色，有浓重的中药味，产率为5.92%。

5.1.4 水提未过柱无患子皂苷

水提未过柱无患子皂苷的吸光度与纯度如表4所示。

表4  水提未过柱无患子皂苷的吸光度与纯度

由表4可知，水提未过柱无患子皂苷纯度为18.82%，相对偏差较小，实验的重复性较好，可信度高。水提未过柱无患子皂苷为红棕色溶液，液体黏度大且有泡沫。

5.1.5 结果分析

从以上结果可知，无患子皂苷的提取受溶剂的影响较大，醇提产率大于水提产率。无患子皂苷主要以三萜类为主，三萜类皂苷有大量的非极性基团，使三萜类皂苷更能与乙醇相容。在相同的条件下，乙醇在植物细胞膜间能更好的流动，更易将皂苷类物质从细胞中溶解带出，故醇提法比水提法所得的皂苷产率高。

另外，（1）水提无患子皂苷比较粘稠，经振荡会产生持久性的泡沫，造成过滤困难；而醇提过程中，乙醇是一种很好的消泡剂，基本不会产生泡沫，提取过程较顺利；（2）关于树脂，HZ-801树脂极性较强，对于多糖、氨基酸、蛋白质吸附性强，导致杂质较多；而AB-8树脂极性较弱，在过柱过程中，很多皂苷以及苷元吸附到大孔树脂上，而多糖、油脂、蛋白质吸附较小，相比之下，AB-8树脂纯化的效果比HZ-801树脂好。

5.2 透明质酸酶抑制率

4种无患子皂苷的透明质酸酶抑制率如图4所示。

图4  4种无患子皂苷的透明质酸酶抑制率

由图4可知，无患子皂苷在不同的提取方法下均有抗过敏作用，尤其是醇提过柱无患子皂苷的抗敏效果较显著，达到37.04%，其次为水提过柱无患子皂苷﹥醇提未过柱无患子皂苷﹥水提未过柱无患子皂苷。

从提取溶剂来看，醇提无患子皂苷活性成分纯度高、杂质较少，因此醇提比水提抗敏作用好；从过柱与否来看，大孔树脂可以有效地对无患子中抗过敏成分进行吸附分离，经树脂纯化的皂苷比未经树脂纯化的抗敏作用好。

5.3 乳霜抗敏效果

表5  无患子皂苷乳霜的抗敏效果

从表5可知，无患子皂苷用量在0.2%~1.0%之间乳霜质地稳定，但超过1.2%时会产生乳析现象，因为无患子皂苷多为表面活性剂，会使乳化体系变稀影响稳定性。无患子皂苷乳霜对皮肤刺激较小，具有较好的抗敏效果，添加量为1%时效果最好。

六．结论

通过本文实验得出结论，醇提过柱无患子皂苷的纯度可达70.89%，水提过柱无患子皂苷的纯度可达30.98%。大孔树脂可以有效地对无患子中抗过敏成分吸附和纯化。对比醇提和水提的效果，醇提方法更优良。透明质酸酶抑制率试验表明，无患子皂苷对透明质酸酶的抑制率达到37.04%，具有较好的抗敏效果，纯度越高，抗敏效果越好。无患子皂苷的添加量为1%时，乳霜的抗敏效果最好。综合对比，醇提过柱是一种高效提取、吸附纯化无患子皂苷的方法，所得产物应用于抗敏化妆品中具有优良的抗敏效果，拥有可观的应用前景。

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